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產(chǎn)品分類：

Nexell細(xì)胞系/株 Nexell原代細(xì)胞 Nexell細(xì)胞培養(yǎng)液感受態(tài) 定制培養(yǎng)基微生物智能冷鏈箱血液制品細(xì)胞培養(yǎng)耗材 Nexell輔助試劑

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相關(guān)產(chǎn)品

Y2HGold Chemically Competent Cell

產(chǎn)品貨號(hào)：CC96403

產(chǎn)品規(guī)格：10 ×100ul/100×100ul

產(chǎn)品價(jià)格： ￥電議

點(diǎn)擊次數(shù)：1212

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標(biāo)簽：感受態(tài)

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產(chǎn)品簡介

Y2HGold 菌株是 Clontech 公司開發(fā)的 GAL4 系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa 型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒

或與 MATα 型酵母菌株 Y187 通過 mating 操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫試驗(yàn)。Transformation marker

為：trp1，leu2，報(bào)告基因?yàn)椋?AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。Y2HGold-GAL4 酵母雙雜系統(tǒng)需要兩

種質(zhì)粒配套使用：pGBKT7 和 pGADT7。質(zhì)粒 pGBKT7 的篩選標(biāo)志為 TRP1，用于表達(dá) DNA-BD (來

自酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4N 端 1 ~ 174 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Bait) 的融合蛋白；質(zhì)粒 pGADT7 的篩選

標(biāo)志為 LEU，用于表達(dá) AD(GAL4 C 端 768 ~ 881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4 系

統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4 可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于 N 端 1 ~ 174

位氨基酸區(qū)段的 DNA 結(jié)合域 (DNA-BD)和位于 C 端 768 ~ 881 位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域 (AD)。

DNA-BD 能夠識(shí)別 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并與之結(jié)合。而 AD 可以啟動(dòng) UAS

下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD 和 AD 單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的 GAL4

活性，使含有 UAS 的啟動(dòng)子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD 不與 AD 結(jié)合，將要檢測的蛋白

質(zhì)分別與 BD 和 AD 融合，形成 bait 融合蛋白 (bait -BD)和 prey 融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait 和

prey 發(fā)生相互作用，就會(huì)促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的 GAL4，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)

錄。Y2HGold 有四個(gè)報(bào)告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分別由三種不同的啟動(dòng)子 (G1，G2，

M1) 啟動(dòng)，這三種啟動(dòng)子只有 GAL4 識(shí)別的 17 bp 核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母

雙雜假陽性發(fā)生的概率。此外新報(bào)告基因 AbAr 與以前的營養(yǎng)缺陷報(bào)告基因相比具有更低背景的優(yōu)

點(diǎn)，也可以降低酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。Y2HGold 感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存

三個(gè)月，pGADT7 質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA。

產(chǎn)品組分

名稱

規(guī)格

儲(chǔ)存方式

Y2HGold Competent Cell

100 μl /支

-80℃（3 個(gè)月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)

10 μl

-80℃（12 個(gè)月）

Carrier DNA (10 μg/μl)

100 μl

-20℃（12 個(gè)月）

PEG/LiAC

5 ml

4℃（12 個(gè)月）

基因型：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3,

GAL2UAS- Gal2TATA-Ade2 URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1

使用方法：

1. 從-80℃取出 Y2HGold 感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒 2-5 µg，Carrier

DNA (95-100℃，5 min，快速冰浴，重復(fù)一次) 10 µl，PEG/LiAc 500 µl ，吸打混勻，30℃水浴 30

min (15 min 時(shí)翻轉(zhuǎn) 6 - 8 次混勻)。

32. 42℃水浴 15 min (7.5 min 時(shí)翻轉(zhuǎn) 6 - 8 次混勻)。

3. 5000 rpm 離心 40 s 棄上清，ddH2O 400 µl 重懸，離心 30 s 棄上清。

4. ddH2O 50 µl 重懸，涂板，29℃培養(yǎng) 48 - 96 h。

● 培養(yǎng)基配制

① YPDA (1L): Tryptone 20 g ，Yeast extract 10 g ，0.2% adenine 15 ml 補(bǔ)水到 950 ml，用鹽酸調(diào) pH

到 6.5； Agar 20 g(for plates only) 121℃，15 min 高壓滅菌；待培養(yǎng)基溫度降到 55℃時(shí)，加入已過

濾的 40% 葡萄糖 50 ml。

② SD medium (1L): Yeast Nitrogen base 6.7 g ，葡萄糖 20 g ，Dropout 適量（按說明書）補(bǔ)水到 1L，

調(diào) pH 至 5.8； Agar 20 g(for plates only) 121℃，15 min 高壓滅菌。

③ 0.2% adenine (1L): Adenine 2 g,，補(bǔ)水到 1 L；溶解后高壓滅菌或 0.22 µm 濾膜過濾除菌。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3. 同時(shí)轉(zhuǎn)化 2 - 3 種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4. Y2HGold 酵母菌株對(duì)高溫敏感，最適生長溫度為 27 - 30℃；高于 31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈

指數(shù)下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長中一個(gè)常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的

Adenine 被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的

ADE2 基因被破壞，Adenine 合成途徑受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物

P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比 YPDA 培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂

板為例：涂 YPDA 平板 29℃，48 h 培養(yǎng)可見直徑 1 mm 克��；涂 SD 單缺平板 29℃，48 - 60 h 培養(yǎng)

可見直徑 1 mm 克隆，涂 SD 雙缺平板 29℃，60 - 80 h 培養(yǎng)可見直徑 1 mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺

平板平板 29℃，80 - 90h 培養(yǎng)可見直徑 1 mm 克隆。

原創(chuàng)作者：上海語純生物科技有限公司

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