Cell Counting Kit-8，簡(jiǎn)稱 CCK-8 試劑盒， 是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測(cè)試劑盒。CCK-8 溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中，不需要預(yù)配各種成分。WST-8 在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色 的 formazan (參考圖 1) 。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺 (生成的 formazan  量)  和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系(圖 2) 。WST-8 是 MTT 的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，和MTT 或其它MTT 類似產(chǎn)品，如 XTT、MTS 等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)：①MTT 被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的 formazan 不是水溶性的， 需要有特定的溶劑來溶解， 而WST-8 和XTT、MTS 產(chǎn)生的 formazan 都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟；② WST-8 產(chǎn)生的 formazan 比XTT 和MTS 產(chǎn)生的 formazan 更易溶解；③WST-8 比 XTT 和 MTS 更加穩(wěn)定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠；④ WST-8 和MTT、XTT 等相比線性范圍更寬， 靈敏度更高，并且更加穩(wěn)定。 WST-8 對(duì)細(xì)胞無明顯毒性。加入 CCK-8 溶液顯色后， 可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板，檢測(cè)時(shí)間更加靈活，便于確定最佳測(cè)定時(shí)間。

操作說明

本試劑盒可以用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測(cè)，也可以用于抗癌藥物等對(duì)細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)，或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)。

1) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

a. 先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞；

b. 按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做 5-7 個(gè)細(xì) 胞濃度梯度，每組 4-6 個(gè)復(fù)孔；

c. 接種后培養(yǎng) 2-4 小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后每 100 μL 培養(yǎng)基加 10 μL CCK-8 試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定 OD 值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量。

2) 細(xì)胞活性檢測(cè)

a. 在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 μL/ 孔) ，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng) 24 小時(shí)；

b. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8  溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡) ；

c. 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時(shí)；

d. 用酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 nm 處的吸光度。

3) 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)

a. 在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 μL/ 孔) ，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng) 24 小時(shí)；

b. 向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測(cè)藥物；

c. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；

d. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8  溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡)；

e. 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時(shí)；

f. 用酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 nm 處的吸光度。

4) 計(jì)算公式

細(xì)胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 實(shí)驗(yàn)孔吸光度 (含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液) ；

Ac: 對(duì)照孔吸光度 (含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物) ；

Ab: 空白孔吸光度 (含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細(xì)胞、藥物) 。

 Cell line : HEK293

Medium : DMEM, 10% FBS

Incubation : 37°C, 5% CO 2, 2 hours
Cell line : U87, SK-HEP1 Medium : DMEM, 10% FBS

Chemicals : 200 μM Cisplatin (DDP)

Incubation : 37°C, 5% CO 2, 2 hours

注：如果待測(cè)藥物有氧化性或還原性，可在加入 CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉待測(cè)藥物的影響。當(dāng)待測(cè)藥物影響比較小的情況下可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入待測(cè)藥物后的空白吸收即可。

保存條件

4°C 一年

-20°C 兩年

長(zhǎng)期保存，建議避光

注意事項(xiàng)

1） CCK-8 的培養(yǎng)時(shí)間一般為 1-4 小時(shí)，但在培養(yǎng) 30 分鐘左右即可取出肉眼 觀察顯色程度，根據(jù)細(xì)胞種類而定，需要摸索條件，

CCK-8 的最佳反應(yīng)時(shí)間以具體顯色的最佳時(shí)間為準(zhǔn)。

2） 使用 96 孔板進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一定要注意蒸發(fā)問題。一方面， 由于 96 孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法， 改加相同量的PBS、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把 96 孔板置 于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

3） 本試劑盒的檢測(cè)依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑 (例如一些抗氧化劑) 會(huì)干擾檢測(cè)，如果待檢測(cè)體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。 用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定。 4）加入藥物中如含有金屬，對(duì) CCK-8 顯色有影響。終濃度為 1 mM 的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制 5% 、15% 、90% 的顯色反應(yīng)，使靈敏度降 低。如果終濃度是10 mM 的話，將會(huì) 100% 抑制。

5） 培養(yǎng)基中的酚紅不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

6） 本產(chǎn)品可以檢測(cè)，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。向 100 μL 培養(yǎng)液中加入 10 μL CCK-8 溶液，并培養(yǎng) 1-4 小時(shí)或過夜。

7） CCK-8 試劑對(duì)細(xì)胞的毒性非常低。它和活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶液顏色不斷加深，OD 值不斷增加 (注: 活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的) 。

8） 要測(cè)定細(xì)胞的具體數(shù)量，建議同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

9） 建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。

10） 以下方法可以終止 CCK-8  反應(yīng) (96 孔板) ：

a.在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置 4°C 冰箱內(nèi)。b.每孔加 10 μL 0.1 M HCl 溶液。(c).  每孔加 10 μL 1% (w/v)  的 SDS (十二烷基硫酸鈉) 溶液。

注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在 24 小時(shí)內(nèi)測(cè)定。11）本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用， 不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

12）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。