細胞操作詳細步驟----貼壁細胞

1.細胞復蘇

1.1離心法

1.1.1準備一個T25的細胞培養(yǎng)瓶并做好標記，預熱好的細胞完全培養(yǎng)基，一支15ml離心管，離心管中加入4-5ml細胞完全培養(yǎng)基。

1.1.2取出細胞凍存管，在37度水浴中快速解凍，將管子擦干并消毒后迅速拿回生物安全柜。

1.1.3將細胞懸液轉(zhuǎn)移到加有培養(yǎng)基的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。

1.1.4倒掉上清，加入培養(yǎng)基輕輕重懸細胞亦可先將細胞團彈散后加入培養(yǎng)基混勻。

1.1.5將重懸好的細胞轉(zhuǎn)移到T25細胞培養(yǎng)瓶，補充培養(yǎng)基到8ml左右，十字搖晃，將細胞鋪勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2不離心法

1.2.1準備一個T25的細胞培養(yǎng)瓶并做好標記，預熱好的細胞完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶中加入8ml左右培養(yǎng)基。

1.2.2取出細胞凍存管，在37度水浴中快速解凍，將管子擦干并消毒后迅速拿回生物安全柜。

1.2.3將細胞懸液轉(zhuǎn)移到加有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，十字搖晃，將細胞鋪勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，接種16小時后更換培養(yǎng)基。

2.細胞傳代

2.1準備細胞完全培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)瓶，胰酶（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA），DPBS。

2.2棄上清，并加2-3mlDPBS輕柔沖洗培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞1-2次。

2.3加入1ml胰酶，室溫或者37度消化，直到細胞成片脫落，加入3-4ml完全培養(yǎng)基終止消化，如果有成團塊脫落的細胞可輕輕吹打分散細胞后再終止消化。（注意：消化時間與所用胰酶效價，消化時候細胞密度以及溫度等因素有關，建議第一次消化時候，多在顯微鏡下觀察，以找到最佳消化時間）

2.4收集細胞懸液，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，加入培養(yǎng)基輕輕重懸細胞亦可先將細胞團彈散后加入培養(yǎng)基混勻。

2.5將重懸好的細胞按比例分裝至T25細胞培養(yǎng)瓶，補充培養(yǎng)基到8ml左右，十字搖晃，將細胞鋪勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3.細胞凍存

3.1準備細胞凍存液，細胞凍存管，胰酶（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA），DPBS。

3.2棄上清，并加2-3mlDPBS輕柔沖洗培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞1-2次。

3.3加入1ml胰酶，室溫或者37度消化，直到細胞成片脫落，加入完全培養(yǎng)基終止消化，如果有成團塊脫落的細胞可輕輕吹打分散細胞后再終止消化。

3.4收集細胞懸液，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清。

3.5加入凍存液，重懸細胞，并分裝到凍存管，凍存密度0.8-1.5×10⁶細胞/ml。

3.6將凍存管放入程序降溫盒，并放到-80℃冰箱，過夜后將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮保存。

4.注意事項

4.1建議收到細胞后先用我們配套的培養(yǎng)基和血清。收到活細胞的客戶培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基可回收使用，保存在4度可使用一周。

4.2不同實驗室操作上會有些許差異，為了避免細胞不適應，請先按照說明書推薦的方法和操作步驟培養(yǎng)，待細胞凍存后可根據(jù)自己的習慣操作看細胞是否能夠適應。

4.3建議收到細胞后，前幾代及時凍存一些細胞，并最好是可以多凍存幾個批次。

原創(chuàng)作者：上海語純生物科技有限公司