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免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）

   1941年，Coons等于首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)（fluorescent antibody technique）。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也 還比較復(fù)雜。

 一、熒光免疫技術(shù)的概念：

        免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。將抗原或抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記的抗原或標(biāo)記的抗體與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng) 后，測(cè)定復(fù)合物中的熒光素，這種免疫技術(shù)稱為免疫熒光素技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補(bǔ)體法。

二、熒光免疫技術(shù)分類：

（1）熒光抗體顯微鏡技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測(cè)方法。

（2）免疫熒光測(cè)定技術(shù)： 抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法

 三、熒光的產(chǎn)生：

        物質(zhì)吸收外界能量而進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以電磁輻射的形式釋放，即發(fā)光，這種光稱為熒光。這種物質(zhì)，稱為熒光素。由光激發(fā)所引起的熒光，為光致熒光；由化學(xué)反應(yīng)所引起的熒光，為化學(xué)熒光。

四、熒光素的熒光特性：

      （1）停止供能，熒光現(xiàn)象隨即終止

      （2）對(duì)光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性入射光波長(zhǎng)<發(fā)射光波長(zhǎng)

      （3）熒光效率：熒光效率=發(fā)射熒光的光量子數(shù) /吸收光的光量子數(shù)

      （4）熒光猝滅現(xiàn)象：熒光素的輻射能力減弱

 五、常見(jiàn)熒光素：

       （1）異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量 為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490～495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目 前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。

       （2）四乙基羅丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光波長(zhǎng)為 570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光。

        （3）四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長(zhǎng)為 550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧�。因其熒光淬滅慢，也可用于�?獨(dú)標(biāo)記染色。

        （4）鑭系：鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，最適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。

        （5）藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進(jìn)行光合作用的自然熒光色素，分子量為240kD的蛋白，最大吸 收峰為564 nm，當(dāng)使用488 nm激光激發(fā)時(shí)其發(fā)射熒光峰值約為576 nm，對(duì)于單激光器的流式細(xì)胞儀來(lái)說(shuō)，推薦使用585±21nm的帶通濾光片，雙激光器的流式細(xì)胞儀推薦使用575±13nm的帶通濾光片。FL2探測(cè)器 檢測(cè)PE。

        （6）多甲藻葉綠素蛋白 （peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學(xué)合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復(fù)合物，分子量約為35kD，最大激發(fā)波長(zhǎng)的峰值在 490nm附近，當(dāng)被488nm氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光的峰值約為677nm。FL3探測(cè)器檢測(cè)PerCP。

        （7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可選擇性地嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對(duì)中。在對(duì)DNA染色時(shí)，需用RNase對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，以排除RNA對(duì)DNA 熒光定量精度的影響。在488nm波長(zhǎng)激發(fā)下，PI的發(fā)射光譜為610-620nm。 FL2探測(cè)器檢測(cè)PI。

 常見(jiàn)熒光素的特性：

        （1）FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。

        （2）RB200：橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光595~600nm，橘紅色熒光。

        （3）TRITC：紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光620nm，橙紅色熒光。

        （4）鑭系：Eu、Tb

        （5）PE：吸收光490～560nm，發(fā)射光595nm，紅色熒光。

        （6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。

 酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)：

     酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如，4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解 成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性磷酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì) 羥基苯乙酸等。鑭系螯合物 某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪 (Eu3+)、鋱 (Tb3+) 等的螯合物可發(fā)射特征性的熒光，而且激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬、發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄、熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，最適合于時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定。

六、合適熒光素的選擇：

         （1）具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。

         （2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。

         （3）熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明。

         （4）標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性

         （5）標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速。

         （6）安全無(wú)毒