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Annexin V 是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸PS 有高度親和力，可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的PS 與凋亡早期細(xì)胞胞膜結(jié)合，將Annexin V 標(biāo)記上熒光染料利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

 

由于凋亡晚期或壞死細(xì)胞膜完整性喪失，細(xì)胞核染色液可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)染色細(xì)胞核，搭配Annexin V 使用可將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開。

 

1．懸浮細(xì)胞：

A．按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，300g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞一次，輕輕重懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

 

B． 取1-5 × 105重懸的細(xì)胞，300g離心5min，棄上清。加入500μL稀釋成1 ×的Annexin V Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞。

 

C． 細(xì)胞懸液中加入5μL的熒光素標(biāo)記-Annexin V和5μL的細(xì)胞核染色液。

 

D．輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15-20min。

 

E． 反應(yīng)完成后立即上機(jī)檢測(cè)。如不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)于冰上避光靜置并于1小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。

 

F． 檢測(cè)

 

1）  流式細(xì)胞儀檢測(cè)

 

處理好的樣本在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

 

2）  熒光顯微鏡分析

 

取一滴用熒光素-Annexin V/細(xì)胞核染色液雙染的細(xì)胞懸液（E步驟處理過(guò)的細(xì)胞懸液）于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。

 

 

 

2． 貼壁細(xì)胞

 

 

 

1）流式細(xì)胞儀檢測(cè)

 

A.  按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，將培養(yǎng)基吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管內(nèi)（待用），PBS清洗培養(yǎng)瓶細(xì)胞一次。

 

B.  培養(yǎng)瓶中加入適量的胰酶消化細(xì)胞，室溫孵育至輕輕吹打可使貼壁細(xì)胞脫落，吸除胰酶消化液，避免胰酶消化過(guò)度。

 

注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，胰酶消化步驟很關(guān)鍵。胰酶消化時(shí)間如果過(guò)短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死的假陽(yáng)性；消化時(shí)間如果過(guò)長(zhǎng)，同樣易造成細(xì)胞膜損傷而出現(xiàn)細(xì)胞壞死的假陽(yáng)性，甚至?xí)�影響�?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-熒光素的結(jié)合從而干擾對(duì)于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。同時(shí)，胰酶細(xì)胞消化液中應(yīng)盡量不含EDTA，因?yàn)镋DTA可能會(huì)影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。

 

C.  加入步驟A中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，300g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞一次，輕輕懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

 

注意：加入細(xì)胞培養(yǎng)液非常重要，一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶（殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-熒光素，導(dǎo)致染色失�。�。

 

D.  取1-5× 105重懸的細(xì)胞，300g離心5min，棄上清。加入500μL稀釋成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞。

 

E.  細(xì)胞懸液中加入5μL的熒光素標(biāo)記-Annexin V和5μL的細(xì)胞核染色液。

 

F.  輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15-20min。

 

G.  反應(yīng)完成后立即上機(jī)檢測(cè)。如不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)于冰上避光靜置并于1小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。

 

H.  流式細(xì)胞儀檢測(cè)

 

 

 

2）熒光顯微鏡原位檢測(cè)

 

注：本方法優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于貼壁不牢而檢測(cè)不到。

 

A.  如果條件可以，在誘導(dǎo)凋亡后，用多孔板離心機(jī)300g離心5min。

 

B.  吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次（如果條件允許，在此前做步驟A）。

 

C.  離心后棄上清，加入500μL稀釋成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液。

 

D.  加入5μL的熒光素標(biāo)記-Annexin V和5μL的細(xì)胞核染色液。

 

E.  移液器輕輕混勻，室溫避光孵育15-20min。

 

F.  Annexin V Binding Buffer工作液洗滌細(xì)胞一次

 

G.  熒光顯微鏡檢測(cè)。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。（如果無(wú)法觀察，可以在孔板下鋪上玻片使細(xì)胞貼附，最后取出用Annexin V Binding Buffer浸潤(rùn)觀察）

 

H.  反應(yīng)完成后應(yīng)立即觀察，取出貼附細(xì)胞玻片時(shí)，避免細(xì)胞干片。