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免疫熒光染色服務(wù)

發(fā)布時(shí)間:2021/3/15 11:02:49點(diǎn)擊次數(shù):479

免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique

        1941年,Coons等于首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)(fluorescent antibody technique)。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是:特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是:非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也 還比較復(fù)雜。

 

一、熒光免疫技術(shù)的概念:

        免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。將抗原或抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記,標(biāo)記的抗原或標(biāo)記的抗體與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng) 后,測(cè)定復(fù)合物中的熒光素,這種免疫技術(shù)稱為免疫熒光素技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補(bǔ)體法。

 

二、熒光免疫技術(shù)分類:

(1)熒光抗體顯微鏡技術(shù):抗原抗體反應(yīng)后,利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測(cè)方法。

(2)免疫熒光測(cè)定技術(shù): 抗原抗體反應(yīng)后,利用特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法

 

三、熒光的產(chǎn)生:

        物質(zhì)吸收外界能量而進(jìn)入激發(fā)狀態(tài),在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以電磁輻射的形式釋放,即發(fā)光,這種光稱為熒光。這種物質(zhì),稱為熒光素。由光激發(fā)所引起的熒光,為光致熒光;由化學(xué)反應(yīng)所引起的熒光,為化學(xué)熒光。

 

四、熒光素的熒光特性:

      (1)停止供能,熒光現(xiàn)象隨即終止

      (2)對(duì)光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性入射光波長(zhǎng)<發(fā)射光波長(zhǎng)

      (3)熒光效率:熒光效率=發(fā)射熒光的光量子數(shù) /吸收光的光量子數(shù)

      (4)熒光猝滅現(xiàn)象:熒光素的輻射能力減弱

 

五、常見(jiàn)熒光素:

       (1)異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) :FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體,其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量 為389.4,最大吸收光波長(zhǎng)為490~495nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520~530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年,是目 前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感,通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。

       (2)四乙基羅丹明 (rhodamine, RB200) :RB200為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙酮,性質(zhì)穩(wěn)定,可長(zhǎng)期保存。最大吸收光波長(zhǎng)為 570nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595~600nm,呈現(xiàn)橘紅色熒光。

        (3)四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC):TRITC為羅丹明的衍生物,呈紫紅色粉末,較穩(wěn)定。最大吸收光波長(zhǎng)為 550nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,呈現(xiàn)橙紅色熒光,與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧。因其熒光淬滅慢,也可用于?獨(dú)標(biāo)記染色。

        (4)鑭系:鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪(Eu3)、鋱(Tb3)、鈰(Ce3)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬,發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄,熒光衰變時(shí)間長(zhǎng),最適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。

        (5)藻紅蛋白(P-phycoerythrin,PE):PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進(jìn)行光合作用的自然熒光色素,分子量為240kD的蛋白,最大吸 收峰為564 nm,當(dāng)使用488 nm激光激發(fā)時(shí)其發(fā)射熒光峰值約為576 nm,對(duì)于單激光器的流式細(xì)胞儀來(lái)說(shuō),推薦使用585±21nm的帶通濾光片,雙激光器的流式細(xì)胞儀推薦使用575±13nm的帶通濾光片。FL2探測(cè)器 檢測(cè)PE。

        (6)多甲藻葉綠素蛋白 (peridinin chlorophyll protein,PerCP):PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學(xué)合成器中發(fā)現(xiàn)的,是一種蛋白復(fù)合物,分子量約為35kD,最大激發(fā)波長(zhǎng)的峰值在 490nm附近,當(dāng)被488nm氬離子激光激發(fā)后,發(fā)射光的峰值約為677nm。FL3探測(cè)器檢測(cè)PerCP。

        (7)碘化丙啶( propidium iodide,PI):可選擇性地嵌入核酸(DNA、RNA)的雙螺旋堿基對(duì)中。在對(duì)DNA染色時(shí),需用RNase對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理,以排除RNA對(duì)DNA 熒光定量精度的影響。在488nm波長(zhǎng)激發(fā)下,PI的發(fā)射光譜為610-620nm。 FL2探測(cè)器檢測(cè)PI。

 

常見(jiàn)熒光素的特性:

        (1)FITC:黃色結(jié)晶粉末,吸收光:490~495nm,發(fā)射光:520~530nm,明亮的黃綠色熒光。

        (2)RB200:橘紅色粉末, 吸收光570nm,發(fā)射光595~600nm,橘紅色熒光。

        (3)TRITC:紫紅色粉末,吸收550nm,發(fā)射光620nm,橙紅色熒光。

        (4)鑭系:Eu、Tb

        (5)PE:吸收光490~560nm,發(fā)射光595nm,紅色熒光。

        (6)其它:酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。

 

酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì):

 

底物

產(chǎn)物

激發(fā)光

發(fā)射光

B-G

MUG

MU

360

450

AP

MUP

MU

360

450

HRP

HPA

二聚體

317

414

 

 

        酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如,4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解 成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性磷酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì) 羥基苯乙酸等。鑭系螯合物 某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪 (Eu3+)、鋱 (Tb3+) 等的螯合物可發(fā)射特征性的熒光,而且激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬、發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄、熒光衰變時(shí)間長(zhǎng),最適合于時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定。

 

六、合適熒光素的選擇:

         (1)具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。

         (2)熒光效率高,標(biāo)記后下降不明顯。

         (3)熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明。

         (4)標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性

         (5)標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速。

         (6)安全無(wú)毒

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