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背景^[1-3]

小鼠骨髓巨噬細胞是取自小鼠骨髓的巨噬細胞，主要用巨噬細胞的體外培養(yǎng)研究實驗。巨噬細胞是先天性和適應性免疫反應的關鍵組成部分，并且由于其強大的吞噬病原微生物活性，它們是抵御外來入侵者的第一道防線。巨噬細胞廣泛分布于全身，存在于淋巴器官，肝臟，肺，胃腸道，中樞神經系統(tǒng)，骨骼和皮膚中。由于他們的重新分配，參與了廣泛的生理和病理過程。

巨噬細胞是高度通用的細胞，能夠識別微環(huán)境改變并維持組織穩(wěn)態(tài)。許多病原體已經進化出通過巨噬細胞作為特洛伊木馬來生存，復制、感染人類和動物并在全身繁殖的機制。最近對進化、遺傳、宿主-病原體相互作用的生化方面重新引起了對巨噬細胞的廣泛關注。

從小鼠組織中分離常駐巨噬細胞產率低且程序復雜，這對于許多功能性巨噬細胞的獲得和研究來說困難重重，同時需要大量相對均一的細胞。這些都制約了原代巨噬細胞的相關研究。而一種重要且有效的替代方法就是用適當的生長因子在體外培養(yǎng)骨髓細胞，以此從骨髓前體細胞分化成大量巨噬細胞。但是制備小鼠骨髓來源的巨噬細胞存在操作復雜，制備率低，涉及試劑較多和周期長等制備問題。

小鼠骨髓來源的巨噬細胞是在巨噬細胞集落刺激因子(m-csf)或l929上清(含巨噬細胞集落刺激因子)等存在下，對未分化的骨髓細胞進行體外分化獲得的原代巨噬細胞，特別可以從轉基因小鼠品系中獲得相應的轉基因小鼠原代巨噬細胞。因此，是廣泛應用于免疫學和細胞生物學中體外研究中的優(yōu)秀模型。

應用^[4][5]

用于PDK1靶向AKT調控小鼠骨髓巨噬細胞向破骨細胞分化的機制研究

PDK1對RANKL和MCSF誘導的小鼠骨髓巨噬細胞向破骨細胞分化產生的影響,探索一條新的破骨細胞分化調控通路,有助于深入了解和認識破骨細胞相關骨質疏松癥發(fā)生的分子生物學調節(jié)機制。

方法:(1)提取及培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓巨噬細胞,破骨細胞誘導分化培養(yǎng)液連續(xù)誘導培養(yǎng)小鼠骨髓巨噬細胞6天,每天鏡下觀察破骨細胞生長情況及形態(tài)學變化,抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)鑒定破骨細胞并計數;

(2) 破骨細胞誘導分化培養(yǎng)液分別誘導培養(yǎng)小鼠骨髓巨噬細胞0、2、4、6天,培養(yǎng)液中不含RANKL為對照組,兩組分別在細胞培養(yǎng)的第0、2、4、6天分別提取細胞總RNA和總蛋白,實時熒光定量PCR檢測PDK1mRNA的表達情況,BCA試劑盒測定蛋白濃度,免疫印跡法檢測PDK1、AKT蛋白的表達及其磷酸化情況;

(3) Negative Control siRNA轉染小鼠骨髓巨噬細胞,按照siRNA:lipofectamin2000為1:0.01-1:0.1(pmol:ul)比例范圍尋找轉染小鼠骨髓巨噬細胞siRNA的最佳濃度并計算轉染效率;

(4) 設計合成三條PDK1-si RNA并分別轉染小鼠骨髓巨噬細胞,轉染48h后,提取各組(空白組、Negative Control siRNA組、PDK1-siRNA-1組、PDK1-siRNA-2組和PDK1-siRNA-3組)細胞的總RNA和總蛋白,采用實時熒光定量PCR檢測各組PDK1 mRNA的表達情況,蛋白印跡法檢測各組PDK1蛋白的表達情況;(5)Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測PDK1-si RNA對小鼠骨髓巨噬細胞增殖能力的影響。

參考文獻

[1]Legumain Regulates Differentiation Fate of Human Bone Marrow Stromal Cells and Is Altered in Postmenopausal Osteoporosis[J].Abbas Jafari,Diyako Qanie,Thomas L.Andersen,Yuxi Zhang,Li Chen,Benno Postert,Stuart Parsons,Nicholas Ditzel,Sundeep Khosla,Harald Thidemann Johansen,Per Kj?rsgaard-Andersen,Jean-Marie Delaisse,Basem M.Abdallah,Daniel Hesselson,Rigmor Solberg,Moustapha Kassem.Stem Cell Reports.2017(2)

[2]Molecular mechanisms of osteoporotic hip fractures in elderly women[J].Ursula F?ger-Samwald,Gyorgi Vekszler,Edith H?rz-Schuch,Sylvia Salem,Markus Wipperich,Peter Ritschl,Mehdi Mousavi,Peter Pietschmann.Experimental Gerontology.2015

[3]Daily or Cyclical Teriparatide Treatment in Women With Osteoporosis on no Prior Therapy and Women on Alendronate[J].Felicia Cosman,Jeri W.Nieves,Marsha Zion,Patricia Garrett,Simon Neubort,David Dempster,Robert Lindsay.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolis.2015(7)

[4]Epidemiology of fractures of the proximal third of the femur in elderly patients[J].Daniel Daniachi,Alfredo dos Santos Netto,Nelson Keiske Ono,Rodrigo Pereira Guimar?es,Giancarlo Cavalli Polesello,Emerson Kiyoshi Honda.Revista Brasileira de Ortopedia(English Edition).2015(4)

[5]何基琛.PDK1靶向AKT調控小鼠骨髓巨噬細胞向破骨細胞分化的機制研究[D].廣西醫(yī)科大學,2018.